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              細胞培養無小事——細胞培養的主要步驟

              發布時間: 2021-09-29  點擊次數: 1611次

               一個小細胞可能會把人弄得吃不下,睡不著,焦頭爛額???信不信還真的有這樣的事情 ,可能整個實驗下來計劃是三個月左右,但實際有時候出手的第一步就遇到了攔路虎,why?細胞總是養不好;天啊,馬上就到了三個月了,SO sad,下面我們就來看看細胞主要的培養步驟吧。


              選對培養基很重要:

              培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長??傊?,一般首先選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始,各種目的無血清培養最好首先選的培養基。 

              GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?

              GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解。

              酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。

              培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?

              丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。 

              一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。 

              大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。這個特別在血清上體現的很明顯,有些血清沉淀特別多,客服都會告訴您這個是血清的析出蛋白,讓您不要離心直接使用也是這個原理 ,因為離心之后您的血清連那么點營養蛋白都沒有啦 

              38 在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解,如果在室溫下放置超過30分鐘,就會變得不穩定 

              同時細胞的狀態也非常重要,有些老師認為,腫瘤細胞反正可以無限傳代,那么我就用之前傳過188代的細胞來做實驗又如何,要是細胞的形態好,可能真的沒有什么問題,但是若細胞形態也不行,那要考慮是否用這個細胞了 ,一般細胞的形態不好涉及到三個方面:1.培養基使用的不對嚴重改變細胞的營養環境,細胞為自救不得不變異以求生長;2.操作手法不對,造成細胞污染等,3.傳代次數太多,因為每次傳代都會給細胞造成輕微的損傷,導致細胞在傳代之后不斷的修復,修復的細胞需要的衍生物,比如血清,培養基,可能會根據配方和批次的不同,給細胞造成不同程度的變異。

              So easy的操作手法:

              第一見細胞的時候,都不知道從何入手,太嬌貴了 ,怎么辦?其實,我們只要記住一點就可以了:無菌操作,無菌操作,無菌操作,重要的事情說三遍,之后我們就可以放開手腳,大干一場了。 

              Step 1 : 冷凍管應如何解凍?

              取出冷凍管后,須立即放入37 C水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管之爆裂。注意:復蘇不一定要離心,除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可。

              如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 

              Step 2:怎么培養?

              培養關鍵點還在傳代操作,一想到傳代,天啊 ,會不會很復雜?首先我們要等到細胞到達80%-85%的密度再進行操作,為什么是這個密度?因為這個密度剛好是細胞生長的鼎盛期,因為細胞和細胞間都會有信號通路互相聯系,這個時候他們都共同商量好了要努力生長,然后傳代之后,他們看到空間還是這么大,就會把努力生長的精神一直傳承下去,直到他們過了生長鼎盛期到生長平頂期為止。當然有些貪婪的聚集成簇生長的細胞,他們會不辭辛苦,日以繼日的生長,直到培養基不能給他們提供一點養分為止。 

              Step 3:不可忽略的重要的傳代過程:

              1.37度水浴加熱*培養基,0.25% 胰蛋白酶/EDTA溶液,我們不建議在37度溫度下加熱試劑和培養基,水浴優先使用。

              2. 用DPBS沖洗細胞,并倒掉洗過的DPBS。

              3. 加入1 ml 0.25% T/E溶液裝入T-25瓶中。輕輕搖動燒瓶,以確保T/E溶液*覆蓋細胞。用顯微鏡觀察細胞形態的變化。

              4.。在孵育期間,準備一個15毫升的錐形離心管與5ml胰酶中止液

              5.在消化時,輕輕敲打培養瓶的側面,將細胞從表面剝離出來。在顯微鏡下檢查,確保所有的細胞間隙變大并且都開始呈流沙狀脫落。

              6.. 向培養瓶中加入5 ml胰酶中止液,將分離的細胞轉移到15ml離心管中。用另外5 mll胰酶中止液清洗培養瓶以收集殘留的細胞。

              7.將15毫升離心管以1000 rpm離心5分鐘,收集消化好的細胞沉淀。

              8.將細胞沉淀分別滴入我們要分瓶的容器里,完成傳代。



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